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2.4.4 线性关系考察
用70%甲醇对贮备液进行逐级稀释,蒙药得到2.024、砂蓝20.240、定性定量50.600、质量101.200、控制151.800μg/m L的研究系列对照品溶液,分别精密吸取溶液各10μL,蒙药注入色谱仪进行测定,砂蓝以对照品的定性定量进样质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),质量进行线性回归,控制得标准曲线方程为Y=35.919 X-4.386 4,研究r=1.000 0,结果表明,蒙药MMQ在2.024~151.800μg/m L线性关系良好。砂蓝
2.4.5 定量限和检测限
取对照品贮备溶液,定性定量逐步稀释,按“2.4.1”项下色谱条件进样,进样量为10μL,信噪比(S/N)为10∶1,测得MMQ的定量限约为2.024μg/m L。信噪比(S/N)为3∶1时,MMQ的检测限约为0.607μg/m L。
2.4.6 精密度试验
选取高、中、低(101.200、50.600、20.240μg/m L)3个质量浓度的对照品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件下同1 d内连续进样6次,测得MMQ峰面积的RSD分别为0.73%、0.95%、1.37%。连续测定3 d,每天进样1次,记录MMQ峰面积,测得MMQ峰面积的RSD分别为2.06%、1.61%、1.88%。结果显示日内、日间精密度均小于3%。表明日内、日间精密度良好,仪器稳定。
2.4.7 重复性试验
取样品粉末0.25 g(S5),按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,平行6份,按“2.4.1”项下色谱条件进样,进样量为10μL,记录MMQ的峰面积。采用外标一点法计算MMQ的含量,样品中MMQ的质量分数为5.28 mg/g,RSD为1.37%,表明此方法重复性好。
2.4.8 稳定性试验
取样品粉末0.25 g(S5),按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样,进样量为10μL,结果显示MMQ峰面积的RSD为1.81%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.9 加样回收率试验
精密称取已知含量的EGT粉末0.125 g(S5)精密称定,按已测定的50%、100%、150%精密加入对照品溶液,按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件进样,记录峰面积,采用外标一点法计算加样回收率。结果MMQ的平均加样回收率为101.5%,RSD为1.46%。
2.4.1 0 定量测定
取7批EGT样品,按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4.1”项下色谱条件进样,经HPLC测定后,结果显示7批EGT(S8、S9因采集时间较久,未测定)的质量分数范围在0.13%~0.53%,见表1。
3 讨论
3.1 指标成分的选择
EGT为蒙古族习用药材,目前无相关的质控标准以及专属性成分的研究,本研究通过MCI色谱、硅胶色谱、高效液相色谱等分离手段,得到专属性成分,经核磁鉴定为一种喹啉酮类生物碱(MMQ)。本实验将EGT与其它4种近源样品:大蓝刺头、硬叶蓝刺头、全缘蓝刺头和蓝刺头,进行薄层色谱和HPLC检测比较,结果显示大蓝刺头、硬叶蓝刺头、全缘蓝刺头不含有MMQ,在蓝刺头样品中虽含有少量MMQ,但远低于其检测线。因此MMQ作为砂蓝刺头中含量较高且专属性较强的成分,建立以其为指标成分定性定量方法,有一定的科学性与实用性,可以更好地评价EGT药材的质量。
3.2 薄层色谱鉴别
在薄层鉴别展开剂的考察中,发现酸对于薄层展开体系的影响较大,非酸体系下,斑点较少、分离度较差。筛选了多种显色剂,包括磷钼酸、碘化铋钾、碘、10%硫酸乙醇等,显色效果均不佳,不显色或者显色不灵敏,最终定为以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶1∶1∶0.8)为展开剂,254 nm紫外灯下检视荧光斑点即可。比较了不同厂家的薄层板:银龙-HSGF254板、黄海-HSGF254板、德国MNSGF板和德国MNHSGF板,所建立的薄层方法在上述几种板中均能获得很好的展开效果,其中以德国MNHSGF板分离效果最好。
3.3 指纹图谱建立
中药色谱指纹图谱能够较为全面地反映中药的整体质量。本实验建立指纹图谱分析方法能很好地将EGT与同属其他植物相区别。相似度分析评价中,S9(批号20120815)相似度仅为0.679,其他EGT样品相似度均高于0.9,这提示EGT样品陈置过久可能会影响其药材质量。这一发现为药材市场中EGT药材年限控制提供数据参考。不同来源的9批样品指纹图谱中的共有峰在数目以及相对保留时间上保持一致,但各共有峰相对峰面积有一定的差异,说明各批次药材之间的质量存在差异,推测可能与药材产地、生长年限、采收期等因素有关。将EGT和其他种蓝刺头的指纹数据进行统计分析,主成分分析和聚类分析结果一致,均能实现EGT与同属其他植物(蓝刺头、全缘叶蓝刺、硬叶蓝刺头和大蓝刺头)的区别。在PCA中,16批样品聚为2大类,S1~S9号样品为不同批次EGT,S10~16号样品为蓝刺头属其他种样品,其中S8和S9号样品为2012年收集的样品,虽经放置多年,成分有所下降,但仍归为EGT中。在聚类分析中,S8和S9号样品处于同一组中;S14和S15号样品为全缘蓝刺头也在同一组中,该结果与OPLS-DA结果一致。
3.4 含量测定
在建立MMQ的定量分析方法实验中,进行了提取方法(超声、加热回流)、提取溶剂(纯甲醇、70%甲醇、50%甲醇)、提取时间和提取次数的考察。最终确定的提取方便操作简单、省时,对砂蓝刺头中MMQ提取率高。考察了乙腈-水、乙腈-醋酸铵缓冲盐水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流动相体系对液相色谱分离效果的影响。最终确定的含测方法重复性好,MMQ的分离度和含量测定RSD均符合检测要求。另外,由于S8和S9药材采集时间过久,为了不影响含量限度制定的准确性,未对这2批药材进行含量测定。
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