1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液

精密称取桑辛素、高效甘草酸、液相药内异甘草素、色谱散及桑皮苷A、指纹质量地骨皮乙素、图谱芹糖甘草苷、泻白甘草素、其种异甘草苷、单味甘草苷、高效绿原酸、液相药内甘草酸铵、色谱散及东莨菪内酯、指纹质量大黄素对照品适量，图谱用甲醇配制成质量浓度分别为30、泻白82、其种53、65、60、20、95、100、77、85、80、165、38μg/mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液

按照《小儿药证直诀》中泻白散配比，取适量炒桑白皮、地骨皮、炙甘草，粉碎，过孔径为（250±9.9）μm（65目）筛，混合均匀，制成试验用泻白散粉末。精密称取1.00g泻白散粉末，加水至30mL，回流提取1h，放冷，补重，以3000r/min离心5min，过滤上清液，取续滤液10mL，按照体积比为1:1加入甲醇，混匀，静置过夜，过滤上清液，滤液经0.45μm微孔滤膜滤过，得泻白散供试品溶液，备用。同法分别制备不同批次的泻白散、炒桑白皮、地骨皮、炙甘草供试品溶液。

1.4 实验方法

采用高效液相色谱法，按1.2色谱条件测定泻白散及其3种单味药饮片样品溶液，得到各批泻白散、单味药高效液相色谱指纹图谱，计算各批泻白散样品之间、单味药样品之间、对照品与泻白散样品之间指纹图谱的相似度，对泻白散中的共有色谱峰进行指认。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

分别考察了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液系统对测定结果的影响，结果发现乙腈-0.1%甲酸水溶液条件下色谱峰分离度较好，基线稳定，故选择乙腈-0.1%甲酸水溶液进行优化梯度洗脱条件；分别比较60、100、120、150min的检测时间对测定结果的影响，结果发现120、150min均可检测出泻白散中所有的色谱峰，为节省时间，选择检测时间为120min；采用DAD-UV检测器对200～400nm检测波长进行考察，发现在254nm波长下，色谱峰最多，泻白散信息量最大，最终选择检测波长为254nm。

2.2 料液比的优化

《小儿药证直诀》记载泻白散制法及用法“上锉散，入粳米一撮，水二小盏，煎七分，食前服”，依据《浙江省中药炮制规范》（2015年版）确定炒桑白皮工艺为取桑白皮饮片，照清炒法炒至表面微黄，微具焦斑时，取出摊凉。参考王彦帅等确定的经典名方泻白散物质基准制备工艺：取炒桑白皮3.93g，焙地骨皮3.93g，炙甘草0.39g，粳米1.50g，加水360mL煎煮，料液比约为1:37。遵循古代经方制法、煎煮原则，分别将炒桑白皮、地骨皮、炙甘草粉碎，过孔径为（250±9.9）μm筛，进行加热回流提取，最终确定料液比为1:30，较为接近古代煎煮工艺。

2.3 方法学验证

2.3.1 精密度试验

取桑皮苷A对照品溶液，在1.2色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰面积。结果显示，测定结果的相对标准偏差为0.21%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取泻白散组方X10样品，按1.3.2制备样品溶液，在1.2色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24h进样6次，记录色谱峰面积。结果显示，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.25%～1.02%，其中各主要色谱峰保留时间无明显变化，测定结果的相对标准偏差为0.01%～1.21%，表明样品稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取泻白散组方X10样品，按1.3.2制备样品溶液6份，在1.2色谱条件下各进1次，记录色谱峰面积。结果显示，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.25%～2.85%，其中各主要色谱峰的保留时间无明显变化，测定结果的相对标准偏差为0.13%～1.56%，表明该方法的重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的建立

2.4.1 炒桑白皮指纹图谱测定

13批全国不同饮片企业市售桑白皮炒制品（S1～S13）按照1.3.2制备供试品溶液，在1.2色谱条件下测定，将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版），HPLC指纹图谱匹配结果见图1。由图1可知，13个批次之间的相似度为0.024～0.975，差别非常大，炒桑白皮样品S8中，各成分的含量非常低，虽然外观性状符合炒桑白皮正品特征，但内在质量非常差，推测该样品可能存放时间太久所致。除S8炒桑白皮样品外，其它12批炒桑白皮仅有7个共有峰。

2.4.2 地骨皮指纹图谱

将13批全国不同饮片企业市售地骨皮（D1～D13）按照1.3.2制备供试品溶液，在1.2色谱条件下测定，将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版），HPLC指纹图谱匹配结果见图2。由图2可知，13个批次之间的相似度为0.061～0.983，差别非常大，地骨皮样品D11、D12、D13与其它样品的相似度非常低，D12、D13色谱峰数量及分布与其它地骨皮样品差别较大，虽然外观性状均符合地骨皮正品特征，但内在质量差异较大。13批地骨皮仅有4个共有峰。

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